通過(guò)EEG腦電記錄的方法評(píng)估顳葉癲癇小鼠KA模型建模效果。建模成功的小鼠具有比較頻繁的自發(fā)性癲癇發(fā)作，根據(jù)建模效果和注射位置的不同，小鼠癲癇發(fā)作情況和病理表現(xiàn)也有略微的不同。

顳葉癲癇小鼠KA模型是一種被廣泛應(yīng)用在顳葉癲癇疾病研究中的動(dòng)物模型，大量的研究表明，顳葉癲癇小鼠模型可以在一定水平上模擬人類(lèi)顳葉癲癇患者地疾病進(jìn)程，有助于顳葉癲癇發(fā)病機(jī)制地研究以及抗癲癇化合物地篩選。在顳葉癲癇小鼠KA模型建立過(guò)程中，最關(guān)鍵的主要有兩點(diǎn)：第一，保證KA在有效期內(nèi)；第二，注射位點(diǎn)位于海馬CA區(qū)。

創(chuàng)新性：

本模型與以往的基于電點(diǎn)燃或化學(xué)點(diǎn)燃的模型不同，通過(guò)單側(cè)海馬注射海人酸的顳葉癲癇小鼠模型，其致癲灶僅僅局限在一側(cè)海馬內(nèi)。造模成功后，單側(cè)海馬形成典型的海馬硬化病理改變。這一模型能在最大程度上模擬顳葉癲癇患者的單側(cè)海馬病變，并且具備起源于海馬的自發(fā)性癲癇放電和癲癇發(fā)作的表現(xiàn)，是一種良好的篩選治療難治性顳葉癲癇的小鼠模型。

動(dòng)物模型制備所用野生型C57BL/6小鼠均具有檢疫合格證明。

1. KA注射后的急性癲癇發(fā)作

KA注射后5 min小鼠開(kāi)始有輕微癲癇發(fā)作，如面部胡須抽動(dòng)，逐漸發(fā)作為全身性的強(qiáng)直-陣攣性癲癇發(fā)作，進(jìn)入癲癇發(fā)作急性期[6]。小鼠表現(xiàn)出前后肢抽搐，弓背等行為。急性期癲癇發(fā)作大概持續(xù)1-3個(gè)小時(shí)后可自行恢復(fù)。

2. 病理驗(yàn)證

顳葉癲癇小鼠模型在KA注射4周后，取小鼠大腦做病理切片和免疫組化染色，可見(jiàn)單側(cè)海馬出現(xiàn)如下的改變：（1）CA1-CA3區(qū)錐體神經(jīng)元出現(xiàn)廣泛的死亡（蘇木素染色或DAPI染色可見(jiàn)核固縮現(xiàn)象）；（2）GFAP染色可見(jiàn)KA注射測(cè)海馬有明顯的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生；（3）蘇木素染色可見(jiàn)海馬齒狀回顆粒細(xì)胞出現(xiàn)明顯的散布。如果不具備此類(lèi)病理改變，則建模失敗。

3. 腦電圖驗(yàn)證

KA注射后4周后小鼠進(jìn)入慢性期癲癇發(fā)作，具有穩(wěn)定的自發(fā)性癲癇發(fā)作。在此階段在小鼠頭部埋置腦電記錄電極，通過(guò)EEG腦電記錄，記錄癲癇發(fā)作情況評(píng)估建模效果[7, 8]。一般來(lái)說(shuō)，建模成功的小鼠在腦電記錄上表現(xiàn)出明顯的癲癇尖波放電，每只小鼠大概每周有3次以上的自發(fā)性癲癇發(fā)作。同步視頻記錄可以觀察到在腦電出現(xiàn)同步化異常放電時(shí)，小鼠出現(xiàn)明顯的前后肢抽搐行為。如果不具備異常腦電和癲癇發(fā)作行為，則建模失敗。

4. 公開(kāi)發(fā)表的論文依據(jù)

本模型的建立工作發(fā)表論文：何婷婷等.構(gòu)建海人酸誘導(dǎo)的內(nèi)側(cè)顳葉癲癇小鼠模型.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床.2011;31(7):820-824.

應(yīng)用本模型篩選得到Hsp90抑制劑17AAG可用于治療顳葉癲癇小鼠的癲癇發(fā)作，研究結(jié)果發(fā)表于知名實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)期刊：Sha LZ, et al. Pharmacologic Inhibition of Hsp90 to Prevent GLT-1Degradation as an Effective Therapy for Epilepsy. Journal of ExperimentalMedicine. 2017;214(2):547-563.

實(shí)驗(yàn)材料

8-10周齡雄性C57BL/6小鼠，1ng/nl KA工作液，5%水合氯醛溶液，3% H2O2，75%醫(yī)用酒精，醫(yī)用消毒棉簽，手術(shù)器械，手術(shù)縫合線(xiàn)，小動(dòng)物立體定位注射儀，醫(yī)用小動(dòng)物打孔器，一次性醫(yī)用注射器，微量注射玻璃針。

實(shí)驗(yàn)環(huán)境

屏障環(huán)境，無(wú)菌操作臺(tái)。

實(shí)驗(yàn)方法

1. 小鼠麻醉，一次性醫(yī)用注射器腹腔注射200 ul 5%水合氯醛（小鼠體重按照20g算），小鼠深度麻醉后（顳葉輕輕夾腳趾無(wú)反應(yīng)，呼吸均勻）轉(zhuǎn)移到小動(dòng)物立體定位注射儀上，固定頭部。

2. 用眼科剪剪去小鼠頭部毛發(fā)，暴露頭皮，75%醫(yī)用酒精消毒皮膚，用消毒后的鑷子從中縫位置夾起頭皮，眼科剪沿中縫靠右2 mm處剪開(kāi)10 mm左右的創(chuàng)口，暴露顱骨。

3. 用醫(yī)用棉簽蘸取3% H2O2，輕輕擦拭顱骨表面組織；醫(yī)用棉簽蘸取75%醫(yī)用酒精擦去殘留的H2O2，醫(yī)用棉簽擦凈顱骨表面。

4. 醫(yī)用小動(dòng)物打孔器按照坐標(biāo) AP=2.0 mm，ML=1.8 mm打孔，打孔后用醫(yī)用棉簽蘸取75%醫(yī)用酒精擦去骨粉。

5. 小動(dòng)物立體定位注射儀安裝好微量注射玻璃針后抽取200 nl KA，按照坐標(biāo)AP=2.0 mm，ML=1.8 mm，DV=2.3 mm進(jìn)針，接下來(lái)開(kāi)始注射，注射速度 200 nl/min。注射完成后停針2 min。2 min后收回微量注射玻璃針。

6. 使用手術(shù)縫合線(xiàn)縫合小鼠頭頂傷口，消毒傷口附近皮膚。注射結(jié)束后的小鼠放在舒適恒溫的環(huán)境中使其自然蘇醒，小鼠蘇醒后放回原來(lái)的籠位中，及時(shí)補(bǔ)充食物和飲水。

研究目的及意義

癲癇是最常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，據(jù)估計(jì)，全世界范圍內(nèi)約有5000萬(wàn)癲癇患者，每年的癲癇發(fā)生率約為240萬(wàn)。我國(guó)目前約有900萬(wàn)的癲癇患者，約占全世界癲癇患者總數(shù)的1/5[1-4].

部分性癲癇患者約占癲癇患者總數(shù)的60%，部分性癲癇是指癲癇的病灶位于大腦半球中的一個(gè)或者位于一側(cè)大腦半球的局部區(qū)域內(nèi)[4]。顳葉癲癇是部分性癲癇的常見(jiàn)類(lèi)型。顳葉癲癇患者中約有1/3的患者對(duì)于常見(jiàn)的抗癲癇藥物治療無(wú)效，這使得顳葉癲癇成了成人最難治療的癲癇類(lèi)型。對(duì)于這些患者，手術(shù)切除治療是唯一的治療選擇。顳葉癲癇手術(shù)治療前需要準(zhǔn)確定位致癲組織，手術(shù)切除時(shí)更需要完整切除致癲灶。但是由于致癲組織切除不足，仍有30%左右患者出現(xiàn)癲癇復(fù)發(fā)。對(duì)于無(wú)法準(zhǔn)確定位致癲組織的癲癇患者來(lái)說(shuō)，手術(shù)切除并不適合他們[1, 5]。

綜上，顳葉癲癇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型可以為顳葉癲癇的組織病理學(xué)研究和臨床治療提供幫助。其中受到廣泛使用的就是顳葉癲癇小鼠海人酸模型。

海人酸（kainic acid, KA）是L-谷氨酸的環(huán)狀類(lèi)似物以及離子型KA受體激動(dòng)劑，最早從海藻中提取，當(dāng)作殺蟲(chóng)劑使用。KA處理神經(jīng)元可以誘導(dǎo)強(qiáng)烈的去極化作用最終導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡，這也是顳葉癲癇主要的病理表現(xiàn)[6]。KA處理的嚙齒類(lèi)動(dòng)物最開(kāi)始具有急性期癲癇發(fā)作，隨后進(jìn)入4-5周的潛伏期，最終進(jìn)入難治性的自發(fā)性癲癇發(fā)作階段。KA處理的嚙齒類(lèi)動(dòng)物會(huì)有海馬硬化相關(guān)的病理表現(xiàn)，包括海馬神經(jīng)元丟失，顆粒細(xì)胞散布，苔狀纖維發(fā)芽等，這與顳葉癲癇患者的病理表現(xiàn)接近[6]。

使用顳葉癲癇小鼠海人酸模型可以很好地模擬顳葉癲癇患者地臨床表現(xiàn)，為顳葉癲癇發(fā)病機(jī)制的研究以及抗顳葉癲癇藥物的研發(fā)提供幫助。

國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展

Nadler等人第一批報(bào)道KA對(duì)海馬神經(jīng)元有影響。這些實(shí)驗(yàn)表明，在Sprague-Dawley大鼠腦室內(nèi)注射KA（0.5 nmol）1-3天后導(dǎo)致海馬吻端CA3區(qū)錐體細(xì)胞變性，而高劑量（0.8μg）則導(dǎo)致海馬尾更多區(qū)域的神經(jīng)元丟失[6]。高于0.8μg的劑量可以導(dǎo)致海馬CA1和CA2區(qū)域神經(jīng)元變性。Ben-Ari等人的研究中發(fā)現(xiàn)杏仁核內(nèi)注射KA能夠引起海馬神經(jīng)退行性病變和癲癇發(fā)作行為。Cepeda等報(bào)道在狒狒杏仁核內(nèi)注射KA可引起雙側(cè)海馬損傷和癲癇持續(xù)狀態(tài)（status epilepticus ,SE）。上述研究表明杏仁核和海馬內(nèi)注射KA可以再現(xiàn)顳葉癲癇患者腦組織相關(guān)病理變化，這種動(dòng)物模型可以代表顳葉癲癇模型[6]。