1.評(píng)價(jià)指標(biāo)體系

該模型是化學(xué)刺激誘導(dǎo)的豚鼠咳嗽模型，咳嗽次數(shù)和咳嗽潛伏期是主要的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

2. 國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有模型的異同

該模型是化學(xué)誘導(dǎo)的豚鼠咳嗽模型，相比于現(xiàn)有模型在造模方法基本一致，以辣椒素吸入誘導(dǎo)豚鼠咳嗽，不同點(diǎn)在與對(duì)于咳嗽的計(jì)數(shù)方法，目前現(xiàn)有的咳嗽計(jì)數(shù)方法主要是通過(guò)豚鼠咳嗽時(shí)候的狀態(tài)結(jié)合咳嗽時(shí)豚鼠出現(xiàn)的聲音判斷咳嗽，具有較大的主觀性而且對(duì)于細(xì)小的咳嗽不易察覺(jué)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)全身體積描記系統(tǒng)記錄的豚鼠呼吸波形，表征咳嗽波形圖，通過(guò)出現(xiàn)典型的咳嗽波形圖判斷咳嗽，記錄較客觀，同時(shí)對(duì)于一些細(xì)小的咳嗽也可以通過(guò)波形圖判斷和記錄。

3. 技術(shù)難點(diǎn)

（1）通過(guò)呼吸波，濾過(guò)干擾波形，找出典型的咳嗽的波形圖。

（2）辣椒素的濃度摸索。因豚鼠對(duì)辣椒素極敏感，且安全窗較窄，極易出現(xiàn)因辣椒素刺激造成的呼吸困難甚至死亡，本研究前期進(jìn)行了不同濃度的辣椒素霧化探索，最終選擇10-4mol/L辣椒素作為造模濃度，建立穩(wěn)定可靠的豚鼠咳嗽模型。

4. 創(chuàng)新性

使用WBP肺功能檢測(cè)系統(tǒng)準(zhǔn)確描記豚鼠在腔體內(nèi)因咳嗽產(chǎn)生的劇烈呼氣氣流變化，通過(guò)豚鼠咳嗽呼吸波形變化科學(xué)的記錄豚鼠咳嗽次數(shù)。使咳嗽的判斷和技術(shù)客觀，準(zhǔn)確。

5. 應(yīng)用價(jià)值

采用定量霧化辣椒素法，建立豚鼠咳嗽模型，通過(guò)WBP體積描記系統(tǒng)監(jiān)測(cè)豚鼠咳嗽波形變化，記錄咳嗽潛伏期及咳嗽次數(shù)。相較于人工觀察并結(jié)合動(dòng)物咳嗽聲音記錄咳嗽的方法，本研究方法更加科學(xué)，客觀，是對(duì)現(xiàn)有咳嗽模型較好的優(yōu)化和提升。因此，該模型為鎮(zhèn)咳藥物的篩選、藥效評(píng)價(jià)及可能的機(jī)制探索提供了一個(gè)穩(wěn)定可靠的動(dòng)物模型。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用SPF級(jí)豚鼠，動(dòng)物飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所和平里園區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，屏障系統(tǒng)豚鼠房飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)設(shè)施許可證SYXK（京）2019-0003。飼養(yǎng)期間給予動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)飼料和潔凈飲水。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵守國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求。

除前面采用咳嗽次數(shù)及咳嗽潛伏期作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)采用右美沙芬作為陽(yáng)性對(duì)照藥WBP肺功能檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)豚鼠咳嗽波形進(jìn)行監(jiān)測(cè)，可實(shí)時(shí)描記豚鼠咳嗽波形圖，。

1實(shí)驗(yàn)材料1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Hartley豚鼠60只，SPF級(jí)，雌雄各半，體重260~300 g，動(dòng)物合格證號(hào)：No.110011221101387556。考慮到運(yùn)輸過(guò)程對(duì)動(dòng)物體重的影響，到達(dá)動(dòng)物的體重在±10%范圍內(nèi)的豚鼠全部接收，一并進(jìn)行檢疫和適應(yīng)。

1.2實(shí)驗(yàn)材料

1.2實(shí)驗(yàn)試劑

辣椒素：北京索萊寶科技有限公司；無(wú)水乙醇：北京化工廠；吐溫80：北京化工廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

全身體積描記系統(tǒng)Buxco Finepointe Whole Body Plethysmograph 4-Site System (WBP) ；美國(guó)DSI公司生產(chǎn)。

1.4 飼養(yǎng)管理

實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)：動(dòng)物飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所和平里園區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，屏障系統(tǒng)豚鼠房飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)設(shè)施許可證SYXK（京）2019-0003。

飼養(yǎng)環(huán)境：溫度：20~26℃，相對(duì)濕度：40～70%；換氣次數(shù)：≥15次/h；照明時(shí)間：人工光照12 h明暗周期；清掃與消毒：每日清掃動(dòng)物房?jī)?nèi)環(huán)境的地面和門(mén)，每周定期采用84消毒液或過(guò)氧乙酸進(jìn)行擦拭消毒。

籠具：聚丙烯豚鼠飼養(yǎng)盒，上附金屬格柵蓋。每盒飼養(yǎng)5只豚鼠。消毒與更換：每周2次更換飼養(yǎng)盒，每月更換金屬格柵蓋，采用山東新華醫(yī)療器械股份有限公生產(chǎn)的XG1-I型脈動(dòng)真空滅菌器對(duì)飼養(yǎng)盒和金屬格柵蓋進(jìn)行滅菌消毒。

飼料：SPF豚鼠生長(zhǎng)繁殖飼料，購(gòu)自北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供。

墊料：軟木刨花，每周2次更換墊料（與動(dòng)物盒更換同時(shí)進(jìn)行）。換下來(lái)的含有糞便尿液的墊料由與中藥所簽訂合同的生物廢物處理公司處理。

飲用水：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲用水，易神州（北京）科技有限公司生產(chǎn)的RO-300型反滲透制水機(jī)制得；置于500 mL聚丙烯水瓶中，插在飼養(yǎng)盒水瓶孔中，動(dòng)物可自由攝取。每周3次更換水瓶，水瓶用山東新華醫(yī)療器械股份有限公生產(chǎn)的XG1-I型脈動(dòng)真空滅菌器進(jìn)行滅菌消毒。

動(dòng)物尸體處理：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中剖殺的動(dòng)物的尸體，用包裝袋妥善包裝，放入-20℃冰柜保存，交由簽訂合同的生物廢物處理機(jī)構(gòu)處理。

2實(shí)驗(yàn)方法2.1分組及實(shí)驗(yàn)

Hartley豚鼠50只，雌雄各半。按體重隨機(jī)分5組，每組10只：模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（右美沙芬20 mg/kg）、受試物低、高劑量組（30 、60 mg/kg）、霧化受試物組（40 mg/kg）。按5 mL/kg劑量灌胃給藥，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃給予氫溴酸右美沙芬溶液，受試物低、高劑量組灌胃給予相應(yīng)體積的藥液，霧化受試物組霧化給藥30 min，每天1次，連續(xù)3 d。模型組不處理。

2.2 咳嗽模型

按預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)以0.15 mL/min的速率霧化10-4mol/L辣椒素刺激2min，由全身體積描記系統(tǒng)記錄豚鼠咳嗽潛伏期T（s）及霧化開(kāi)始12min內(nèi)咳嗽次數(shù)Ct（次）。

3數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean ± SEM）表示，采用SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P < 0.05為產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

4實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示全身體積描記系統(tǒng)記錄的豚鼠咳嗽波形圖，呼吸波形中出現(xiàn)明顯氣流波動(dòng)，與前后呼吸波形成強(qiáng)烈對(duì)比，示意豚鼠咳嗽一次，如圖2所示。

與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組豚鼠咳嗽潛伏期及咳嗽次數(shù)均顯著減少，結(jié)果具有顯著性差異（P<0.01和P<0.01），受試物高劑量組及霧化受試物組可顯著降低模型豚鼠咳嗽次數(shù)（P<0.05和P<0.05），結(jié)果見(jiàn)表2，圖2。

表 2受試物對(duì)辣椒素致咳豚鼠的影響（x ?±s, n=10）

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

圖2 各組豚鼠咳嗽出現(xiàn)了明顯的呼吸波的變化

1實(shí)驗(yàn)材料1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Hartley豚鼠60只，SPF級(jí)，雌雄各半，體重260~300 g，動(dòng)物合格證號(hào)：No.110011221101387556。

1.2實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)試劑

辣椒素：北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：423G021；無(wú)水乙醇：北京化工廠，批號(hào)：20210617；吐溫80：北京化工廠，批號(hào)：20210301。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器

全身體積描記系統(tǒng)Buxco Finepointe Whole Body Plethysmograph 4-Site System (WBP) ；美國(guó)DSI公司生產(chǎn)。

2實(shí)驗(yàn)方法 Hartley豚鼠，進(jìn)入全身體積描記系統(tǒng)軟件系統(tǒng)，設(shè)置好參數(shù)，將動(dòng)物放置于腔體內(nèi)，按預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)以0.15 mL/min的速率霧化10-4mol/L辣椒素刺激2min，由全身體積描記系統(tǒng)記錄豚鼠咳嗽潛伏期T（s）及霧化開(kāi)始12min內(nèi)咳嗽次數(shù)Ct（次）。3數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean ± SEM）表示，采用SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P< 0.05為產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖1全身體積描記裝置

咳嗽波形圖2：10-4mol/L組吸入辣椒素后期呼吸波出現(xiàn)了典型的變化

1. 目的

采用WBP肺功能檢測(cè)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)腔內(nèi)豚鼠因咳嗽產(chǎn)生的高速呼氣氣流造成腔內(nèi)氣流變化，準(zhǔn)確描記豚鼠咳嗽行為，記錄霧化辣椒素誘發(fā)豚鼠咳嗽次數(shù)，構(gòu)建穩(wěn)定客觀的記錄咳嗽次數(shù)的豚鼠咳嗽模型。用于鎮(zhèn)咳藥物的篩選、藥效評(píng)價(jià)研究及其可能的作用機(jī)制探索。為研究人類(lèi)咳嗽提供依據(jù)。

2. 意義

采用化學(xué)刺激誘導(dǎo)的豚鼠的咳嗽模型是研究咳嗽常用的動(dòng)物模型，然而目前對(duì)于模型咳嗽的判斷主要是基于動(dòng)物形態(tài)以及聲音，其主觀性比較大而且對(duì)細(xì)小的咳嗽難以發(fā)現(xiàn)和計(jì)數(shù)。我們采用WBP肺功能檢測(cè)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)腔內(nèi)豚鼠因咳嗽產(chǎn)生的呼氣氣流造成腔內(nèi)氣流變化，準(zhǔn)確描記豚鼠咳嗽行為，對(duì)誘導(dǎo)的咳嗽進(jìn)行計(jì)數(shù)，使之客觀化和準(zhǔn)確化。本研究采用定量霧化辣椒素誘導(dǎo)的豚鼠咳嗽模型，應(yīng)用體積描記法監(jiān)測(cè)豚鼠咳嗽波形變化，計(jì)數(shù)咳嗽發(fā)生時(shí)間和次數(shù)，構(gòu)建穩(wěn)定的咳嗽模型，是是對(duì)于化學(xué)誘導(dǎo)豚鼠咳嗽模型的優(yōu)化和提升。

3. 國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展

目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中報(bào)道目前已有的咳嗽模型均以少數(shù)經(jīng)典，具有代表性的動(dòng)物模型為主，在造模方法上包括機(jī)械化、化學(xué)和電刺激等方法刺激動(dòng)物的神經(jīng)和感受器，引發(fā)咳嗽。其中機(jī)械刺激法常采用聚乙烯管或者小鬃毛插入麻醉動(dòng)物喉部或者氣管內(nèi)進(jìn)行機(jī)械刺激，引發(fā)劇烈咳嗽，但是機(jī)械刺激法動(dòng)物必須在麻醉情況下進(jìn)行試驗(yàn)[1]，且刺激強(qiáng)度無(wú)法控制，誤差較大使模型的應(yīng)用受限。化學(xué)刺激法多采用化學(xué)物質(zhì)刺激呼吸系統(tǒng)引發(fā)咳嗽，目前常用氨水、二氧化硫、枸櫞酸、辣椒素等刺激性物質(zhì)，氣霧吸入或者采用直接注入呼吸道的方法，刺激呼吸道感受器，誘發(fā)咳嗽。咳嗽模型采用的動(dòng)物包括小鼠、大鼠、貓和犬。如YiKuang等將小鼠置于1000mL玻璃罐中，暴露于2mL的25%氨水中，人工記錄小鼠咳嗽潛伏期及咳嗽次數(shù)[2]。AdesolaA等采用歐姆龍霧化器霧化檸檬酸法，誘導(dǎo)豚鼠咳嗽，記錄豚鼠咳嗽次數(shù)[3]。李沛波等采用電刺激法采用一定頻率和強(qiáng)度的電流刺激貓的喉上神經(jīng)、氣管粘膜或者胸膜等部位引咳[4]。其中采用化學(xué)吸入刺激法誘導(dǎo)的豚鼠是目前較為常用的模型。

目前已有的咳嗽模型咳嗽的計(jì)數(shù)多采用人工計(jì)數(shù)法，主要通過(guò)動(dòng)物形態(tài)結(jié)合動(dòng)物咳嗽聲音等判斷咳嗽的發(fā)生，人為因素較大，而且對(duì)于一些細(xì)小的咳嗽難易發(fā)現(xiàn)和計(jì)數(shù)，影響模型客觀性和可靠性，如何準(zhǔn)確計(jì)數(shù)咳嗽是咳嗽模型需要解決和提升的問(wèn)題。

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[3]Adejayan AA, Ozolua RI, Uwaya DO, Eze GI, Ezike AC. Evaluation of the anti- asthmatic and antitussive potentials of methanol leaf extract of Napoleona vogelii in rodents. Biomed Pharmacother. 2019 Jan;109:120-126.

[4]李沛波,蘇暢,畢福均,王永剛,彭維,蘇薇薇.化州柚提取物止咳作用及其機(jī)制的研究[J].中草藥,2008(02):247-250.