該模型在研究輻射損傷及機(jī)體老齡化相關(guān)的損傷中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。國(guó)內(nèi)已有相關(guān)單位咨詢引用。

在誘導(dǎo)模型過(guò)程中，照射設(shè)備具有自身屏蔽裝置，使用安全，不會(huì)對(duì)人體及環(huán)境造成任何影響。

1. 受照小鼠受照后外周血計(jì)數(shù)檢測(cè)

C57小鼠接受4Gy和6GyTBI，6m后全自動(dòng)血液分析儀測(cè)定外周血，發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞數(shù)（WBC）、紅細(xì)胞數(shù)（RBC）、血紅蛋白含量（HGB）、淋巴細(xì)胞百分比（LY%）下降，與假照射組小鼠有明顯差異。中性粒細(xì)胞百分比（NE%）（圖1）。

注：A.白細(xì)胞計(jì)數(shù)B.紅細(xì)胞計(jì)數(shù)C.血紅蛋白濃度D.血小板計(jì)數(shù)E.中性粒細(xì)胞百分比F.淋巴細(xì)胞百分比。*：P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001。

圖1. 受照組小鼠與對(duì)照組小鼠外血計(jì)數(shù)比較

2.免疫臟器系數(shù)

與對(duì)照組小鼠相比，4Gy組和6Gy組小鼠胸腺系數(shù)降低，。其中6Gy組與對(duì)照組差異有顯著性（P＜0.05），脾臟系數(shù)略有增加，差異無(wú)顯著性，結(jié)果見圖2。

注：A.胸腺系數(shù)B.脾臟系數(shù)。*：P＜0.05。

圖2. 受照組小鼠與對(duì)照組小鼠臟器系數(shù)比較

3.外周血免疫分型

相對(duì)于對(duì)照組，4Gy組和6Gy組CD4+均有上升，從分別從12.49±1.16%上升到14.6±0.51%和16.48±2%，均具有顯著性差異（P＜0.05）。CD8a+細(xì)胞三個(gè)組別之間未見明顯變化。CD4/CD8比值分別為對(duì)照組：1.16±0.10，4Gy照射組1.28±0.17，6Gy照射組1.46±0.26，6Gy組CD4/CD8比值與對(duì)照組比較有明顯上升（P＜0.05）。B220+細(xì)胞從對(duì)照組62.89±2.33%降低到4Gy照射組55.63±3.61%和6Gy照射組54.2±3.54%，差異均具有極顯著性（P＜0.001）。NK1.1+細(xì)胞與B220+細(xì)胞變化趨勢(shì)一樣，分別從8.44±0.7%降低到6.81±1.58%和6.6±0.65%。上述三組4Gy和6Gy之間差異均無(wú)顯著性區(qū)別。單核細(xì)胞三個(gè)組別之間未見到明顯差異。結(jié)果見圖3。

注：A. CD4+ B. CD8+ C. B220+ D. NK1.1+ E. CD11b&F4/80+F. CD4+/CD8+。*：P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001。

圖3. 老年小鼠與年輕小鼠外周血免疫細(xì)胞分型比較

4.脾臟免疫細(xì)胞分型

相較于對(duì)照組，照射組CD3+細(xì)胞有上升的趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異。B220細(xì)胞，照射組均有明顯下降，4Gy組和6Gy組相較于對(duì)照組有極顯著差異（P＜0.01），兩組之間未見明顯差異。見圖4。

注：A. CD3+ B. B220+。**：P＜0.01。

圖4.受照組小鼠與對(duì)照組小鼠脾臟免疫細(xì)胞分型比較

5.脾臟T細(xì)胞P16mRNA表達(dá)量檢測(cè)

結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，6Gy組有個(gè)別數(shù)據(jù)p16 mRNA明顯升高，采用卡方檢驗(yàn)，未見顯著性差異。結(jié)果見圖5。

圖5.受照組小鼠與對(duì)照組小鼠脾臟T細(xì)胞的P16 mRNA表達(dá)比較

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

10~12周齡的SPF級(jí)雄性健康C57BL/6J小鼠，體重22~24g，共24只，購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK（京）2014-0004]。小鼠飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物房屏障環(huán)境[SYXK(津)2014－0002]。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所IACUC的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為1402。并根據(jù)3R原則對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用和飼養(yǎng)給予人道關(guān)懷。

2.試劑與儀器

熒光標(biāo)記抗體NK1.1-FITC購(gòu)于Biolegend公司；CD11b-APC，購(gòu)于Invitrogen公司；B220-percp、F4/80-PE、CD4-PE-cy7、CD8a-APC-cy7購(gòu)于BD公司；B220-percp-cy5.5、CD3-APC購(gòu)于biolegend公司。EDTA-K3購(gòu)于sigma公司。紅細(xì)胞裂解液購(gòu)于Invitrogen公司。大鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞分離液試劑盒購(gòu)于索萊寶公司。EasySep?Mouse T Cell Isolation Kit購(gòu)于STEMCELL Technologies公司。全自動(dòng)血液分析儀MEK-7222K（日本光電）；BD流式分析儀（BDFACSAria II cell sorter，BD Bioscience ）。銫源伽馬射線輻照儀（Gammacell-40，加拿大原子能有限公司）。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1.小鼠分組和照射

小鼠均分為三組：對(duì)照組（假照射組），4Gy IR組（4Gy組），6Gy IR組（6Gy組）,照射劑量率為1Gy/min。小鼠于SPF級(jí)動(dòng)物房中飼養(yǎng)，照射后每天觀察記錄體重變化。

2 小鼠外周血常規(guī)檢測(cè)

小鼠TBI后6m小鼠眼眶靜脈叢取血，抗凝管收集外周血，全自動(dòng)血液分析儀測(cè)定外周血中白細(xì)胞數(shù)（WBC）、紅細(xì)胞數(shù)（RBC）、血紅蛋白含量（HGB）和血小板（PLT）等指標(biāo)。

3 小鼠胸腺、脾臟指數(shù)測(cè)定

小鼠TBI 后6m稱重安樂(lè)死，取胸腺、脾臟并稱重，計(jì)算臟器指數(shù)，臟器指數(shù)=臟器(mg)/體重(g)。

4 外周血免疫細(xì)胞和脾臟淋巴細(xì)胞分型檢測(cè)

小鼠TBI后6m，將分離的小鼠脾臟研磨制備脾細(xì)胞懸液。分別取外周血和細(xì)胞懸液50μL，各加入1mL 1×紅細(xì)胞裂解液，室溫條件下裂解8min（期間混勻兩次），1500r/min離心5min，4℃。棄上清，保持每個(gè)樣本100μL體系，加入對(duì)應(yīng)的混合抗體，冰上避光孵育30min。2mL PBS洗一遍，離心條件不變。加入300μLPBS過(guò)濾到流式管中，上機(jī)檢測(cè)。

5 脾臟T細(xì)胞分離及P16mRNA表達(dá)量檢測(cè)

小鼠TBI后6 m，按索萊寶ficoll試劑盒和STEMCELLTechnologies的T細(xì)胞陰選試劑盒說(shuō)明書方法進(jìn)行分離。將收集的細(xì)胞重懸計(jì)數(shù)，按每1~5×106個(gè)細(xì)胞加入1mL trizol保存，送至上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司檢測(cè)P16mRNA表達(dá)量。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPadPrism 6軟件(SanDiego，CA，USA)處理數(shù)據(jù)、作圖，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x?± s）表示，組間差異采用ANOVA檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

一、疾病概述

隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，核電設(shè)施使用增多，人類太空活動(dòng)能力提升使輻射暴露的可能性不斷增加。另外臨床接受放射性治療癌癥患者也在不斷上升。造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)對(duì)電離輻射（Ionizing Radiation，IR）具有高度的敏感性。受照后不僅會(huì)引起急性骨髓抑制，對(duì)遠(yuǎn)期造血免疫功能也會(huì)有影響。受到亞致死劑量照射后會(huì)出現(xiàn)造血免疫系統(tǒng)急性損傷性變化。隨著時(shí)間延長(zhǎng)機(jī)體各項(xiàng)免疫指標(biāo)逐步恢復(fù)，但也會(huì)出現(xiàn)一些持久性改變，從而影響機(jī)體的健康狀態(tài)。

二、模型背景

1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背景信息

C57BL/6J小鼠，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。

2、研究背景

該動(dòng)物模型的研究目的及意義；該動(dòng)物模型的國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展并附參考文獻(xiàn)。隨著核電站的建立，人類太空活動(dòng)的增加，臨床上放射診療設(shè)備的廣泛應(yīng)用，以及核武器恐怖威脅等因素的存在，人類的輻射暴露性可能性日益增加。2001年美國(guó)國(guó)家輻射保護(hù)委員會(huì)指出，當(dāng)出現(xiàn)核事故，多數(shù)人可能受到1．10Gy齊J量的電離輻射(Ionizingradiation，IR)照射。輻射引起的重要臟器損傷會(huì)導(dǎo)致受照射人員死亡。其中，骨髓抑制(bonemarrow suppression)是一個(gè)主要的致死原因。骨髓抑制分為急性骨髓抑制(acutebone marrow suppression)和長(zhǎng)期骨髓抑制(10ng—termbone marrow suppression)，急性骨髓抑制主要是電離輻射引起的造血祖細(xì)胞(hernatopoieticprogenitor cells，HPCs)和少量的造血干細(xì)胞(hematopoieticstem cells，HSCs)凋亡，以及誘導(dǎo)造血祖細(xì)胞增殖障礙。臨床上，可以給予造血細(xì)胞因子(hemopoieticfactors，HGF)緩解癥狀。長(zhǎng)期骨髓抑制是輻射遠(yuǎn)期損傷的主要表現(xiàn)，也是臨床進(jìn)行腫瘤放療、化療時(shí)最常見的毒副作用之一，直接影響到治療效果及患者的生存質(zhì)量。長(zhǎng)期骨髓抑制不像急性期骨髓抑制，往往患者外周血象并無(wú)明顯異常，尤其給予細(xì)胞因子治療后，外周血白細(xì)胞有了較好的恢復(fù)；長(zhǎng)期骨髓抑制具有遲發(fā)性，在臨床上容易被忽視，目前尚無(wú)有效治療手段。

從細(xì)胞層面，電離輻射可以誘導(dǎo)造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞細(xì)胞的凋亡，損傷造血千細(xì)胞、祖細(xì)胞的增殖能力，誘導(dǎo)造血干細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，無(wú)法維持在靜止期，并且會(huì)損傷造血干細(xì)胞微環(huán)境的功能。

從分子層面，輻射誘導(dǎo)的DNA損傷，氧化應(yīng)激和端粒縮短均是造血干細(xì)胞衰老的誘因。其中IR誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激或活性氧水平升高具有重要作用。電離輻射誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactiveoxygen species，ROS)的表達(dá)。ROS主要包括超氧陰離子(02-)，羥自由基(HO-)，過(guò)氧化氫(H2O2)，單線態(tài)氧(1O2)，次氯酸(HOCI)等組成。ROS正常條件下可以調(diào)節(jié)多種生理活動(dòng)，病理?xiàng)l件下，產(chǎn)生過(guò)量的ROS則會(huì)引起DNA損傷，基因組不穩(wěn)定性增加，隨著年齡的增加，ROS損傷產(chǎn)物的累積會(huì)引起細(xì)胞衰老以及衰老相關(guān)的疾病。細(xì)胞ROS主要由線粒體呼吸產(chǎn)生，近來(lái)研究結(jié)果顯示，由于造血干細(xì)胞大多數(shù)處于靜止期，線粒體含量與骨髓中其他細(xì)胞相比線粒體含量非常低，在造血干細(xì)胞中，主要是由NADPH氧化酶家族中(NADPHoxidases，NOXs)的NOX4產(chǎn)生的ROS來(lái)調(diào)控造血干細(xì)胞的功能。HSCs比分化的細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激更敏感。

但是現(xiàn)有研究階段缺乏輻射引起長(zhǎng)期的造血系統(tǒng)損傷數(shù)據(jù)。對(duì)長(zhǎng)期造血系統(tǒng)損傷缺乏深入研究。有待進(jìn)一步研究長(zhǎng)期造血系統(tǒng)損傷對(duì)整個(gè)機(jī)體及造血系統(tǒng)微環(huán)境的影響。

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